Mutagenese- und Aktivitätsstudien an AurF, einer Mn-abhängigen N-Oxygenase Export

@mastersthesis{citeulike:3909122, abstract = {Aromatische Nitroverbindungen sind relativ seltene funktionelle Gruppen in Naturstoffen, zeigen aber oft bemerkenswerte Bioaktivit\"{a}t. Bis heute kennt man nur zwei Enzyme, die die Reaktion von einem Arylamin zu einer Arylnitroverbindung katalysieren, die Rieske-Zentrum enthaltende Aminopyrrolnitrin-N-Oxygenase (PrnD) und die manganabh\"{a}ngige p-Amino- benzoat-N-Oxygenase (AurF). In dieser vorliegenden Diplomarbeit wurden Mutations- und Aktivit\"{a}tsstudien an AurF mit dem Ziel durchgef\"{u}hrt, die Metallselektivit\"{a}t zu ver\"{a}ndern und die Substratspezifit\"{a}t zu verringern. Mutationen der metallkoordinierenden Aminos\"{a}ure Histidin H223 zeigten, dass diese Aminos\"{a}ure einen Einfluss auf die Stabilit\"{a}t des gesamten Proteins nahm. Desweiteren scheint diese Aminos\"{a}ure bei der Metallselektivit\"{a}t f\"{u}r den Cofaktor Mangan eine Rolle zu spielen. In die Substratbindetasche wurden Mutationen eingef\"{u}hrt und die Mutanten auf verschiedene Substrate in in vitro- und in vivo-Enzymassays getestet. Aus den Ergebnissen wurde ein erweitertes Substratbindemodell aufgestellt. Wahr- scheinlich wird das Substrat \"{u}ber Wasserstoffbr\"{u}cken fixiert. Au{\ss}erdem wurde hieraus ein hypothetischer radikalischer Mechanismus mit \"{U}bergangszustand abgeleitet. In in vitro-Enzymassays mit PABA konnte das bisher noch nicht nachgewiesene Nitroso-Intermediat aufgefunden werden, das im Modell der sequentiellen N- Monooxygenierung postuliert wurde. Aus Aktivit\"{a}tsstudien mit AurF-Varianten, die in Kulturen unter unterschiedli- chem Mangan-Eisen-Verh\"{a}ltnissen produziert worden waren, konnte die Ab- h\"{a}ngigkeit der Aktivit\"{a}t von Mangan weiter bekr\"{a}ftigt werden. Bisher waren die Redoxpartner von AurF, die das katalytische Zentrum in vivo regenerieren, noch unbekannt. Versuche mit typischen organischen Coenzymen schlugen fehl, aber daf\"{u}r konnte mit bioinformatischen Methoden ein Wasser- stoffbr\"{u}ckennetzwerk vorgeschlagen werden, das vermutlich Elektronen in das Innere schleust. Dar\"{u}ber hinaus ergaben sich aus Vergleichen mit verwandten Enzymen Hinweise, dass die Elektronen wom\"{o}glich von einem Ferredoxin stammen. Au{\ss}erdem wurde AurF auf Katalaseaktivit\"{a}t untersucht. Es konnte aber keine katalytische Zersetzung von Wasserstoffperoxid beobachtet werden. Insgesamt wurden mit dieser Arbeit Erkenntnisse \"{u}ber AurF vertieft, vorge- schlagene Mechanismen best\"{a}tigt und hypothetische Modelle der Substratbin- dung und des Elektronentransfersystems aufgestellt.}, author = {Fries, Alexander}, citeulike-article-id = {3909122}, keywords = {aureothin, aurf, manganese, n-oxidation}, month = {November}, posted-at = {2009-01-19 20:08:57}, priority = {2}, school = {Friedrich-Schiller-Universit\"{a}t Jena}, title = {Mutagenese- und Aktivit\"{a}tsstudien an AurF, einer Mn-abh\"{a}ngigen N-Oxygenase}, year = {2008} }

TY - THES ID - citeulike:3909122 L3 - citeulike-article-id:3909122 N2 - Aromatische Nitroverbindungen sind relativ seltene funktionelle Gruppen in Naturstoffen, zeigen aber oft bemerkenswerte Bioaktivität. Bis heute kennt man nur zwei Enzyme, die die Reaktion von einem Arylamin zu einer Arylnitroverbindung katalysieren, die Rieske-Zentrum enthaltende Aminopyrrolnitrin-N-Oxygenase (PrnD) und die manganabhängige p-Amino- benzoat-N-Oxygenase (AurF). In dieser vorliegenden Diplomarbeit wurden Mutations- und Aktivitätsstudien an AurF mit dem Ziel durchgeführt, die Metallselektivität zu verändern und die Substratspezifität zu verringern. Mutationen der metallkoordinierenden Aminosäure Histidin H223 zeigten, dass diese Aminosäure einen Einfluss auf die Stabilität des gesamten Proteins nahm. Desweiteren scheint diese Aminosäure bei der Metallselektivität für den Cofaktor Mangan eine Rolle zu spielen. In die Substratbindetasche wurden Mutationen eingeführt und die Mutanten auf verschiedene Substrate in in vitro- und in vivo-Enzymassays getestet. Aus den Ergebnissen wurde ein erweitertes Substratbindemodell aufgestellt. Wahr- scheinlich wird das Substrat über Wasserstoffbrücken fixiert. Außerdem wurde hieraus ein hypothetischer radikalischer Mechanismus mit Übergangszustand abgeleitet. In in vitro-Enzymassays mit PABA konnte das bisher noch nicht nachgewiesene Nitroso-Intermediat aufgefunden werden, das im Modell der sequentiellen N- Monooxygenierung postuliert wurde. Aus Aktivitätsstudien mit AurF-Varianten, die in Kulturen unter unterschiedli- chem Mangan-Eisen-Verhältnissen produziert worden waren, konnte die Ab- hängigkeit der Aktivität von Mangan weiter bekräftigt werden. Bisher waren die Redoxpartner von AurF, die das katalytische Zentrum in vivo regenerieren, noch unbekannt. Versuche mit typischen organischen Coenzymen schlugen fehl, aber dafür konnte mit bioinformatischen Methoden ein Wasser- stoffbrückennetzwerk vorgeschlagen werden, das vermutlich Elektronen in das Innere schleust. Darüber hinaus ergaben sich aus Vergleichen mit verwandten Enzymen Hinweise, dass die Elektronen womöglich von einem Ferredoxin stammen. Außerdem wurde AurF auf Katalaseaktivität untersucht. Es konnte aber keine katalytische Zersetzung von Wasserstoffperoxid beobachtet werden. Insgesamt wurden mit dieser Arbeit Erkenntnisse über AurF vertieft, vorge- schlagene Mechanismen bestätigt und hypothetische Modelle der Substratbin- dung und des Elektronentransfersystems aufgestellt. TI - Mutagenese- und Aktivitätsstudien an AurF, einer Mn-abhängigen N-Oxygenase PB - Friedrich-Schiller-Universität Jena KW - aureothin KW - aurf KW - manganese KW - n-oxidation AU - Fries, Alexander PY - 2008/11// ER -